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聚合酶鏈式反應

日期:2021-07-21瀏覽:3556次

簡介

聚合酶鏈式反應(PCR)是一種用于放大擴增特定的DNA片段的分子生物學技術,它可看作是生物體外的特殊DNA復制,PCR的最大特點是能將微量的DNA大幅增加。PCR的發明者凱利·穆利斯(Kary.B.Mullis)于1993年與邁克爾·史密斯分享了諾貝爾化學獎。

PCR反應過程

聚合酶鏈反應是在一個反應混合物中進行的,該反應混合物包括DNA提取(模板DNA)Taq聚合酶、引物,以及在緩沖溶液中過量的四種脫氧核糖核酸苷三磷酸鹽(dNTPs)PCR的三步驟為變性---退火---延伸。

模板DNA的變性:模板DNA經加熱至94左右一定時間后,使模板DNA雙鏈或經PCR擴增形成的雙鏈DNA解離,使之成為單鏈,以便它與引物結合,為下輪反應做準備;

模板DNA與引物的退火(復性):模板DNA經加熱變性成單鏈后,溫度降至55左右,引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結合;

引物的延伸:DNA模板--引物結合物在Taq酶的作用下,以dNTP為反應原料,靶序列為模板,按堿基配對與半保留復制原理,合成一條新的與模板DNA 鏈互補的半保留復制鏈。

重復循環變性--退火--延伸三過程,就可獲得更多的半保留復制鏈",而且這種新鏈又可成為下次循環的模板。每完成一個循環需24分鐘, 23小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。

臨床應用

PCR在醫學檢驗學中最有價值的應用領域就是對感染性疾病的診斷。理論上,只要樣本有一個病原體存在,PCR就可以檢測到。一般實驗室也能檢出10~100基因拷貝,而目前病原體抗原檢測方法一般需要105-7個病原體才可檢測到。PCR對病原體的檢測解決了免疫學檢測的窗口期"問題,可判斷疾病是否處于隱性或亞臨床狀態。此次武漢新型肺炎中核酸檢測"所使用到的就是基于PCR法的實時熒光定量PCRreal-time PCR)技術。

在許多腫瘤早期和良性的階段,癌基因的表達改變以及突變就已經出現,PCR技術不但能有效的檢測基因的突變,而且能準確檢測癌基因的表達量,可據此進行腫瘤早期診斷、分型、分期和預后判斷。而在腫瘤的個體化用藥中,《個體化醫學檢測質量保證指南》中提到的幾大類檢測方法中,如Sanger測序法、焦磷酸測序法、NGSARMS-PCR法、HRM法,數字PCR法,熒光定量PCR法都是基于PCR法發展的新型技術。

在遺傳病方面,PCR技術的臨床應用就是從檢測鐮狀細胞和β-地中海貧血的基因突變開始的。

PCR是一種現在在細胞和分子生物學中使用普遍的技術。它允許,特別是在幾個小時內,通過自動化系統非細胞克隆"DNA片段,這通常需要幾天的標準技術的分子克隆。另一方面,PCR被廣泛用于診斷目的,以檢測特定的DNA序列的存在這個或那個生物體在生物液體。它還被用來制作遺傳指紋,無論是在司法調查中對一個人的遺傳鑒定,還是對動物品種、植物或微生物進行食品質量檢測、診斷或品種選擇的鑒定。PCR仍然是進行測序或定點突變所必需的。另外還有一些關于PCR技術改良的報道例如金屬有機框架輔助的高效聚合酶鏈式反應。

PCR變體

最后簡單介紹一下PCR的變體,如real-time PCR, competitive PCR, PCR in - situ, RT-PCR等。

遞減PCRtouchdown PCR):前幾循環溫度逐漸下降。

逆轉錄PCRRT-PCR):以由mRNA逆轉錄而來的cDNA為模板,也因為是從表現型基因來進行增量的,由此產生出來的cDNA產物不帶有內含子(基因中不具意義的段落),常應用于分子克隆技術。

熱啟動PCRhot start PCR):以高熱激活型核酸聚合酶進行反應,減少非專一性產物。

實時熒光定量PCRreal-time PCR):PCR過程中利用螢光探針或染料定量檢測,又稱定量PCRquantitative PCR),可以進行多組對比。此次武漢新型肺炎中核酸檢測"所使用到的關鍵技術

巢式PCRnested PCR):先用低特異性引物擴增幾個循環以增加模板數量,再用高特異性引物擴增。

多重PCRmultiplex PCR):在同一個管中使用多組引物。

復原條件PCRreconditioning PCR):PCR產物稀釋10倍后重新放入原濃度的引物和dNTP等循環3次,以消除產物中的異二聚體。

dsRNA合成(dsRNA replicator):合并使用high-fidelity DNA polymersaeT7RNA聚合酶與Phi6 RNA replicase;從雙股DNA轉錄為對應的雙股RNAdsRNA)。可應用于RNAi實驗操作。

COLD-PCR(co-amplification at lower denaturation temperature-PCR):用以檢測突變或特殊等位基因的PCR應用技術。

Digital-PCR:將標準的PCR反應分割至每一個反應中僅1~2copy。藉以偵測微小比例的基因差異。應用于:病原體檢測、癌癥突變基因、借由母血對胎兒做產前檢測。

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